微射流均质机应用专题|脂质体无溶剂规模化制备工艺研究

2026-08-21

		脂质体无溶剂规模化制备工艺研究
	

		 一、介绍 本文隶属于微射流均质机应用专题，全文共 6500字，阅读大约需要 10 分钟。
	

		 二、摘要 本研究旨在解决脂质体制造中大量使用有机溶剂的问题，并成功实施了一种可规模化的无溶剂生产方法。该方法通过高剪切混合干粉脂质与水相缓冲液，再经微射流处理进行粒径控制，能高效制备装载水溶性药物（如阿霉素）和脂溶性药物（如两性霉素B）的脂质体。结果表明，制得的脂质体粒径在100-110 nm、多分散系数低（<0.2），且药物包封率高达97%-100%，证明这种简单、可扩展的无溶剂工艺适用于不同装载特性的脂质体生产。
	

		 三、关键词 载药量；脂质体；制造；粒径；无溶剂
	

		 四、整体框架 
	

		五、引言 脂质体作为一种能同时递送亲水和疏水药物并改善靶向性的载体，已有多个产品在欧美获批上市，且随着专利到期，仿制药数量激增。然而，从实验室到大规模生产，脂质体的制备普遍依赖有机溶剂（如氯仿、甲醇等），这些溶剂根据ICH Q3C指南被归类为具有致癌性或不可逆毒性风险（1类和2类溶剂），其安全处理、去除和处置是生产中的关键难题。虽然已有研究尝试使用危害较小的溶剂（如乙醇、异丙醇），但为追求更可持续的生产方式，本研究开发了一种无需有机溶剂的简便、可规模化的脂质体制造方法，利用微射流均质机控制粒径，并成功制备了装载阿霉素（PEG化及非PEG化）和两性霉素B的脂质体，其粒径和载药量均可对标已临床批准的产品。 
	

		六、材料与方法 磷脂包括蛋黄磷脂酰胆碱（Egg PC）、氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）及聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG 2000）；
胆固醇、琥珀酸钠、柠檬酸、组氨酸、硫酸铵、蔗糖、盐酸阿霉素、两性霉素B、羟丙基-β-环糊精及叠氮化钠等化学试剂；
纯化用300 kDa透析袋及100/750 kDa切向流过滤（TFF）中空纤维柱，所有实验用水均为实验室自制超纯水。 脂质体制备方法及所用溶剂 
	

制备方法	机制	所用溶剂
Bangham法（薄膜水化法）	干燥脂质薄膜再水化	氯仿、甲醇
逆向蒸发法	水相加入有机相，蒸发形成脂质体	乙醚、异丙醚、氟烷、三氟氯乙烷
去垢剂去除法	通过去垢剂-脂质相互作用形成脂质体	氯仿、甲醇
微射流均质法	有机相注入水相，在线沉淀形成脂质体	乙醇、甲醇、异丙醇
致密气体法	以致密气体代替有机溶剂溶解脂质	乙醇、甲醇
乙醇/乙醚注射法	有机相注入水相，沉淀形成脂质体	乙醇、乙醚
超临界流体法	以超临界流体代替有机溶剂溶解脂质	乙醇、甲醇
超临界反溶剂法	脂质溶于超临界CO₂后沉淀为超细颗粒	氯仿、甲醇、乙醇
双不对称离心法	高浓度脂质分散体系经离心稀释于水相	氯仿、甲醇、乙醇
膜接触器法	水相泵入模块，有机相置于加压容器中	乙醇

		 阿霉素脂质体制备（无溶剂法） PEG化（HSPC:Chol:DSPE-PEG2000 = 56:38:5 摩尔比）和非PEG化（Egg PC:Chol = 45:55 摩尔比）空白脂质体通过将干粉脂质和胆固醇加入70°C水合缓冲液、高剪切混合（8000 rpm，1h）制得；随后使用微射流均质机在65-70°C下进行粒径控制，PEG化配方分别在18000和20000 psi下均质2-3次，非PEG化配方在18000 psi下均质3次；粒径减小后的脂质体通过切向流过滤（TFF，100 kDa膜柱）进行外水相置换以建立跨膜梯度（PEG化：硫酸铵→蔗糖-组氨酸；非PEG化：柠檬酸→碳酸钠），加入阿霉素（终浓度2 mg/mL）于60°C孵育10 min实现主动载药，最后经0.22 μm滤器灭菌。 两性霉素B脂质体制备（无溶剂法） 两性霉素B脂质体的制备首先将DSPG（63.3 mg）加入含9%蔗糖的琥珀酸缓冲液（10 mM，pH 2.0）中于70°C高剪切15 min，同时将两性霉素B（37.6 mg）用2 M NaOH溶解后加入上述酸化的DSPG混悬液中，70°C涡旋15 min形成DSPG-药物复合物；随后加入HSPC（159.8 mg）和胆固醇（39.3 mg），高剪切混合1h（70°C）形成脂质体；使用微射流均质机于65-70°C、25000 psi下均质3次进行粒径控制；最后通过TFF（750 kDa膜柱）进行10个透析体积的洗滤，以去除游离药物并完成缓冲液置换。 
	

		表征方法 
	

检测项目	方法	仪器/条件
粒径、PDI、Zeta电位	动态光散射（DLS）	Zetasizer Nano ZS，633 nm激光，173°检测角，稀释至0.2 mg/mL
阿霉素载药量	UV-Vis分光光度法	微板读数仪，490 nm；脂质体用50% 2-丙醇裂解；LOD 0.05 mg/mL，LOQ 0.15 mg/mL
两性霉素B载药量	反相HPLC	Agilent 1100，Gemini C18柱（150×4.6 mm，5 μm），流动相A：0.1%高氯酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱18 min，检测波长408 nm；LOD 0.09 μg/mL，LOQ 0.28 μg/mL
形态学	CryoTEM	Joel Jem F-200，200 kV，液氮冷却乙烷速冻
体外药物释放	USP-4流通池法	SOTAX CE- smart，300 kDa透析管，释放介质：NH₄HCO₃、MES、HP-β-CD、蔗糖、NaN₃（pH 6），流速16 mL/min，温度45°C，6h；UV 490 nm检测

		 七、结果 无溶剂法可制备粒径可控、高载药量的脂质体 在PEG化阿霉素脂质体研究中，随均质压力从15,000 psi增至20,000 psi，粒径从约100 nm降至85 nm，PDI均低于0.2，载药量高达97-98%，且灭菌后各项指标无显著变化；该方法制得的脂质体在粒径和形态上与传统溶剂法相当。非PEG化阿霉素脂质体在18,000 psi、3次均质后粒径为90-100 nm、PDI<0.2、载药量>75%，与市售Myocet形态类似。两性霉素B脂质体在25,000 psi、3次均质后粒径为100-110 nm、PDI约0.2、载药量达98-100%，呈单层或双层囊泡结构。 
	

		压力和均质次数影响粒径但不影响阿霉素释放 采用USP-4流通池法考察不同工艺参数制备的PEG化阿霉素脂质体的体外释放行为，结果显示在18,000和20,000 psi、2次或3次均质条件下制备的脂质体，其6h内的阿霉素累计释放率均约为60%，各组之间无显著差异，而游离阿霉素对照组在2h内即达100%释放；释放后所有制剂的PDI均维持在0.2以下，但粒径均发生显著减小（P<0.05），可能归因于脂质体内药物纳米晶体的流失。 
	

		脂质组成影响可加工浓度上限 通过考察不同脂质配方在无溶剂工艺中的最高可加工浓度发现，低相变温度的Egg PC基脂质体（60 mg/mL）比高相变温度的HSPC基脂质体（40 mg/mL）更易实现粒径控制；添加DSPE-PEG2000或阴离子脂质DSPG后，HSPC配方的最高可加工浓度可从40 mg/mL显著提升至80 mg/mL，Egg PC配方在添加DSPG后亦可达到80 mg/mL。这归因于PEG链提供的立体排斥和强双层间排斥力能有效克服范德华引力，而DSPG提供的静电排斥和水化排斥力同样能防止脂质体聚集并促进小粒径的形成。 
	

图6压力和循环次数对非聚乙二醇化脂质体制剂的粒径、多分散指数(PDI)和载药量的影响

		讨论 传统脂质体制备大多依赖有机溶剂，而溶剂的使用和放大生产问题是纳米药物产业化的主要障碍，甚至曾导致Doxil/Caelyx等产品供应中断。 
	

		展示了一种无溶剂方法，成功制备了三种临床相关脂质体：Doxil（PEG化阿霉素脂质体）、Myocet（非PEG化阿霉素脂质体）和AmBisome（两性霉素B脂质体）。对于阿霉素脂质体，药物通过远程载药法在脂质体形成后装载，无溶剂法所得产品的粒径、载药量和形态均与传统溶剂法相当；对于两性霉素B脂质体，药物掺入脂双层，研究通过质子化改变两性霉素B的水溶性，使其能与DSPG在水相中形成复合物，从而避免了有机溶剂的使用。 
	

		使用高压微射流技术可从实验室规模放大至高通量生产，粒径通过均质压力和次数精确控制，且这两个参数不影响Zeta电位、载药量和药物释放行为。药物释放研究（USP-4法）显示，不同工艺参数制备的脂质体释放曲线一致，说明工艺窗口较宽。
脂质组成方面，含PEG或DSPG的配方能加工至更高的脂质浓度（最高80 mg/mL），这是因为PEG提供空间排斥、DSPG提供静电排斥，二者均能防止脂质体聚集并促进小粒径形成。 
	

		结论 成功开发并验证了一种完全无需有机溶剂、可规模化放大的脂质体制备方法，适用于装载水相内核药物（阿霉素）和脂双层药物（两性霉素B）的多种配方；使用微射流均质机可在高达120 mL/min的流速下通过调节均质压力和次数精确控制粒径和PDI，且这些关键工艺参数不影响药物的装载效率（>90%）和体外释放行为，脂质浓度最高可处理至80 mg/mL，具体浓度上限取决于脂质组成（含PEG或DSPG的配方可达到更高浓度）。 微射流均质处理整体解决方案 
	

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